技術(shù)原理

蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)的主要承擔(dān)者，翻譯調(diào)控又是細(xì)胞內(nèi)重要的調(diào)控方式。翻譯是核糖體讀取mRNA模板來(lái)指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成的過(guò)程，是基因表達(dá)的關(guān)鍵步驟。翻譯的過(guò)程受到嚴(yán)格的調(diào)控，很多疾病與翻譯異常相關(guān)，比如神經(jīng)退行性疾病、貧血癥和發(fā)育障礙等。雖然核糖體的結(jié)構(gòu)與功能研究的比較透徹，但是對(duì)于翻譯過(guò)程的調(diào)控機(jī)理還需要深入研究。

核糖體印跡測(cè)序(Ribosome profiling, Ribo-seq)，能夠詳細(xì)檢測(cè)體內(nèi)的翻譯狀態(tài)。Ribo-seq的技術(shù)核心是識(shí)別與核糖體結(jié)合的mRNA以及正在被翻譯的約30個(gè)核苷酸。對(duì)核糖體結(jié)合的mRNA片段進(jìn)行測(cè)序，能夠精確記錄核糖體在翻譯過(guò)程中的位置。將轉(zhuǎn)錄組與Ribo-seq數(shù)據(jù)聯(lián)合分析，可以計(jì)算出蛋白質(zhì)的合成速率。

技術(shù)特點(diǎn)

Ribo-seq能夠揭示蛋白合成的時(shí)間、地點(diǎn)、位置、哪些蛋白質(zhì)正在被合成以及蛋白質(zhì)合成的調(diào)控機(jī)制。Ribo-seq搭建了從轉(zhuǎn)錄組學(xué)到蛋白質(zhì)組學(xué)之間的橋梁，已經(jīng)廣泛應(yīng)用在動(dòng)物、植物和微生物的研究中，用于揭示生長(zhǎng)發(fā)育、形態(tài)建成、疾病發(fā)生、逆境脅迫響應(yīng)的調(diào)控機(jī)制。

應(yīng)用方向

Ribo-seq應(yīng)用于研究轉(zhuǎn)錄本的翻譯活性、鑒定翻譯起始位點(diǎn)、ORF位置和蛋白質(zhì)的翻譯調(diào)控機(jī)制。

Ribo-seq技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用在動(dòng)物、植物和微生物的研究中，用于揭示生長(zhǎng)發(fā)育、形態(tài)建成、疾病發(fā)生、逆境脅迫響應(yīng)的調(diào)控機(jī)制?？傊?，Ribo-seq能從基因組水平檢測(cè)蛋白質(zhì)的翻譯狀況，獲得正在翻譯的mRNA序列信息并解析翻譯調(diào)控機(jī)制。

藍(lán)景科信優(yōu)勢(shì)

實(shí)驗(yàn)周期快、質(zhì)量高、結(jié)果穩(wěn)定可靠。

豐富的物種經(jīng)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)流程

分析內(nèi)容

標(biāo)準(zhǔn)生信分析

（1）原始數(shù)據(jù)過(guò)濾與測(cè)序質(zhì)量評(píng)估

（2）比對(duì)去除核糖體RNA、tRNA、sRNA等

（3）Reads長(zhǎng)度分布統(tǒng)計(jì)與長(zhǎng)度過(guò)濾

（4）比對(duì)參考基因組

（5）測(cè)序飽和度分析

（6）RF在基因組上的分布統(tǒng)計(jì)與分類(lèi)

（7）三堿基節(jié)律分析

（8）翻譯基因統(tǒng)計(jì)與表達(dá)量分析

（9）樣本關(guān)系分析

（10）組間差異翻譯基因分析

（11）差異翻譯基因的GO和KEGG功能富集分析

Ribo-seq與RNA-seq的聯(lián)合分析

（1）翻譯效率計(jì)算

（2）翻譯效率與轉(zhuǎn)錄水平的關(guān)系分析

（3）翻譯效率與轉(zhuǎn)錄水平的關(guān)聯(lián)分析

分析流程

實(shí)驗(yàn)案例

送樣要求

（1）細(xì)胞樣本：建議送樣量5×106-1×107個(gè)。

（2）動(dòng)物組織樣本：建議送樣量≥300 mg。

（3）植物組織樣本：建議送樣量≥500 mg。

樣本分組

至少2組樣品，包括對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，樣本數(shù)建議：3 Vs 3。

參考文獻(xiàn)

Brar GA, Weissman JS. Ribosome profiling reveals the what, when, where and how of protein synthesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 2015. 16(11):651-664.

Chong C, Coukos G, Bassani-Sternberg M. Identification of tumor antigens with immunopeptidomics. Nat Biotechnol. 2022. 40(2):175-188.

Fremin BJ, Nicolaou C, Bhatt AS. Simultaneous ribosome profiling of hundreds of microbes from the human microbiome. Nat Protoc. 2021. 16(10):4676-4691.

Ingolia NT, Brar GA, Rouskin S, McGeachy AM, Weissman JS. The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments. Nat Protoc. 2012. 7(8):1534-1550.

Ingolia NT, Ghaemmaghami S, Newman JR, Weissman JS. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 2009. 324(5924):218-223.

Juntawong P, Girke T, Bazin J, Bailey-Serres J. Translational dynamics revealed by genome-wide profiling of ribosome footprints in Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci U S A. 2014. 111(1):E203-212.

Sawyer EB, Cortes T. Ribosome profiling enhances understanding of mycobacterial translation. Front Microbiol. 2022. 13:976550.

Xiang Y, Huang W, Tan L, Chen T, He Y, Irving PS, Weeks KM, Zhang QC, Dong X. Pervasive downstream RNA hairpins dynamically dictate start-codon selection. Nature. 2023. 621(7978):423-430.

Xu G, Greene GH, Yoo H, Liu L, Marqués J, Motley J, Dong X. Global translational reprogramming is a fundamental layer of immune regulation in plants. Nature. 2017. 545(7655):487-490.