m6A(N6-Methyladenosine)甲基化修飾已成為近年來科研圈的“明星"（通過Pubmed檢索"m6A"關(guān)鍵詞，可以看出近10年內(nèi)m6A的文章逐年增長(zhǎng)，作為表觀轉(zhuǎn)錄組中化學(xué)修飾之一，m6A在多種生理過程中發(fā)揮著調(diào)控基因表達(dá)的關(guān)鍵作用。在了解m6A甲基化修飾之前，我們先了解一下什么是表觀轉(zhuǎn)錄組。

表觀轉(zhuǎn)錄組

表觀轉(zhuǎn)錄組（Epitranscriptome）指RNA分子上所有可逆化學(xué)修飾的集合，這些修飾不改變RNA序列，但可以通過調(diào)控基因表達(dá)（如翻譯、降解、剪接等）發(fā)揮作用。RNA修飾廣泛存在于各種RNA類型中，包括mRNA、tRNA、rRNA、snRNA、snoRNA、miRNA、siRNA、piRNA和lncRNA等。目前已知的 RNA修飾超過150種，常見類型包括甲基化（如m6A、m5C）、羥基化、假尿苷化（Ψ）等。其中RNA甲基化是最常見的修飾類型之一，在mRNA、tRNA等分子中占比較高（如哺乳動(dòng)物 mRNA 中 m6A 修飾可占甲基化修飾的 80% 以上）。

RNA甲基化，是指在甲基轉(zhuǎn)移酶（如 METTL 家族、CMTR 家族等）的催化下，將甲基基團(tuán)（-CH3）通過共價(jià)鍵連接到RNA分子中核苷酸的特定原子上的修飾過程。RNA 甲基化修飾存在多種類型，包括 m6A、m5C、m1A、m7G 等。

m6A甲基化修飾

m6A甲基化修飾即RNA分子腺嘌呤第6位氮原子（N6位）上的甲基化修飾。m6A甲基化修飾是真核生物mRNA的內(nèi)部修飾之一，約占到mRNA甲基化修飾的80%。m6A在調(diào)控基因表達(dá)（如調(diào)節(jié)mRNA可變剪切、穩(wěn)定性、降解速率及翻譯效率等）中起著重要作用。

m6A修飾主要發(fā)生在RRACH（R = G或A，H = A、C或U ）這類motif上，這類motif主要在mRNA的終止密碼子和3’UTR處富集，即m6A主要發(fā)生在終止密碼子和3’UTR附近。

研究表明，m6A最主要的功能是調(diào)控mRNA穩(wěn)定性：在胞質(zhì)中，m6A修飾可被閱讀器蛋白YTHDF2識(shí)別，通過招募相關(guān)因子將mRNA富集至Processing body（P-body），從而加速其降解。此外，m6A修飾可通過改變RNA局部二級(jí)結(jié)構(gòu)（如莖環(huán)結(jié)構(gòu)），暴露或遮蔽microRNA的結(jié)合位點(diǎn)，進(jìn)而調(diào)控microRNA介導(dǎo)的mRNA降解效率。在核內(nèi)，m6A修飾被核內(nèi)閱讀器YTHDC1識(shí)別后，可通過招募剪接因子（如SRSF家族蛋白）調(diào)控RNA可變剪接，并與核輸出受體NXF1互作促進(jìn)mRNA出核，最終實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)調(diào)控。值得注意的是，m6A與DNA甲基化之間存在雙向互作網(wǎng)絡(luò)，例如m6A甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3可通過穩(wěn)定DNA甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT3A的mRNA，間接增強(qiáng)基因組DNA甲基化水平，而DNA甲基化狀態(tài)也可通過表觀遺傳調(diào)控影響m6A相關(guān)酶的轉(zhuǎn)錄。

? 下圖展示了目前已知的部分m6A的生物功能。

m6A的調(diào)控機(jī)制：

m6A甲基化修飾是動(dòng)態(tài)可逆的生物過程，這種動(dòng)態(tài)變化依賴于多種功能的酶進(jìn)行調(diào)節(jié)，主要包括三種類型：甲基轉(zhuǎn)移酶(Methyltransferases)、去甲基化酶(Demethylases)以及甲基化識(shí)別蛋白(Binding proteins)。

甲基轉(zhuǎn)移酶（Writers）也稱為 “寫入器"，負(fù)責(zé)催化 mRNA 等 RNA 分子的堿基發(fā)生 m6A 甲基化修飾。核心成員包括METTL3/METTL14 復(fù)合物（催化 m6A 的直接添加），以及輔助因子WTAP、VIRMA、KIAA1429等（參與酶復(fù)合物定位或底物識(shí)別），此外還包括METTL16、RBM15/15B、ZC3H3、CBLL1等具有特定生物學(xué)功能的甲基轉(zhuǎn)移酶。

去甲基化酶（Erasers）也稱為 “擦除器"，負(fù)責(zé)催化 m6A 修飾的去除。目前已知的 m6A 去甲基化酶包括FTO和ALKBH5，可特異性移除 mRNA 中的甲基基團(tuán)，實(shí)現(xiàn)修飾的動(dòng)態(tài)調(diào)控。

m6A 識(shí)別蛋白（Readers）也稱為 “閱讀器"，通過特異性結(jié)構(gòu)域識(shí)別m6A修飾的RNA，招募下游效應(yīng)因子或改變RNA構(gòu)象，從而調(diào)控mRNA的穩(wěn)定性、剪接、翻譯等過程。主要分為兩類：

1、含YTH結(jié)構(gòu)域的蛋白：

• 胞質(zhì)型：YTHDF1（促進(jìn)翻譯）、YTHDF2（介導(dǎo)mRNA降解）、YTHDF3（協(xié)同前兩者功能）；

• 核內(nèi)型：YTHDC1（調(diào)控剪接和出核）、YTHDC2（參與翻譯起始）。

2、非YTH結(jié)構(gòu)域的蛋白：

• IGF2BP1/2/3（通過m6A修飾增強(qiáng)mRNA穩(wěn)定性）；

• HNRNPA2B1（識(shí)別m6A并調(diào)控靶基因的選擇性剪接）。

不同物種中，m6A 閱讀器的功能存在特異性：例如，高海拔哺乳動(dòng)物通過YTHDF1 識(shí)別缺氧相關(guān)基因（如 HIF-1α）mRNA 的 m6A 修飾，增強(qiáng)其翻譯效率，從而抵抗缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，體現(xiàn)了表觀調(diào)控對(duì)環(huán)境適應(yīng)的重要性。

M6A甲基化測(cè)序(MeRIP-seq)技術(shù)

m6A修飾早在1970年代通過放射性標(biāo)記技術(shù)被發(fā)現(xiàn)，而其在轉(zhuǎn)錄組中的全基因組分布特征最早通過二代測(cè)序（NGS）技術(shù)揭示。研究表明，在哺乳動(dòng)物中，約25%的mRNA分子含有m6A修飾，平均每個(gè)轉(zhuǎn)錄本攜帶1-3個(gè)修飾位點(diǎn)，主要分布于終止密碼子附近及3'UTR區(qū)域。

甲基化RNA免疫沉淀測(cè)序（MeRIP-seq/m6A-seq）通過特異性抗體富集含m6A的RNA片段，結(jié)合高通量測(cè)序可定位到約100 nt分辨率的修飾區(qū)域，已廣泛用于m6A修飾的檢測(cè)。

MeRIP-seq/m6A-seq技術(shù)原理為通過特異識(shí)別m6A修飾的抗體，對(duì)細(xì)胞內(nèi)具有m6A修飾的RNA片段進(jìn)行免疫共沉淀。對(duì)沉淀下來的RNA片段進(jìn)行高通量測(cè)序，結(jié)合生物信息學(xué)分析，即可在全基因組范圍內(nèi)系統(tǒng)解析m6A修飾的分布特征、富集序列模式及潛在調(diào)控功能。該技術(shù)是目前研究 m6A 修飾廣泛使用的方法之一，已被應(yīng)用于揭示m6A在發(fā)育、疾病等過程中的動(dòng)態(tài)調(diào)控機(jī)制。

MeRIP-seq是基于免疫沉淀富集技術(shù)，該技術(shù)包括IP和input兩個(gè)文庫(kù)：IP文庫(kù)是通過m6A特異性抗體富集含甲基化修飾的RNA片段，用于檢測(cè)m6A修飾的分布；Input文庫(kù)為未進(jìn)行免疫沉淀的RNA樣本（處理流程與IP一致），作為對(duì)照用于排除非特異性結(jié)合。 通過比較IP與Input文庫(kù)的測(cè)序信號(hào)，可繪制全基因組范圍內(nèi)的m6A修飾圖譜，單獨(dú)的input文庫(kù)可視為RNA-seq文庫(kù)，可用于進(jìn)行表達(dá)圖譜的分析。

文庫(kù)構(gòu)建原理圖如下：

生信分析流程示意圖如下：

今天為大家介紹的內(nèi)容以基礎(chǔ)知識(shí)為主，旨在為大家筑牢理論根基，希望能對(duì)大家有所助益。后續(xù)我們將為大家分享m6A的應(yīng)用實(shí)例，敬請(qǐng)期待！

參考文獻(xiàn)

1、Cui L, Ma R, Cai J, Guo C, Chen Z, Yao L, Wang Y, Fan R, Wang X, Shi Y. RNA modifications: importance in immune cell biology and related diseases. Signal Transduct Target Ther. 2022 Sep 22;7(1):334.

2、Jiang X, Liu B, Nie Z, Duan L, Xiong Q, Jin Z, Yang C, Chen Y. The role of m6A modification in the biological functions and diseases. Signal Transduct Target Ther. 2021 Feb 21;6(1):74.

3、Ma S, Chen C, Ji X, Liu J, Zhou Q, Wang G, Yuan W, Kan Q, Sun Z. The interplay between m6A RNA methylation and noncoding RNA in cancer. J Hematol Oncol. 2019 Nov 22;12(1):121.

4、Qin Y, Li L, Luo E, Hou J, Yan G, Wang D, Qiao Y, Tang C. Role of m6A RNA methylation in cardiovascular disease (Review). Int J Mol Med. 2020 Dec;46(6):1958-1972.

5、Gu J, Zhan Y, Zhuo L, Zhang Q, Li G, Li Q, Qi S, Zhu J, Lv Q, Shen Y, Guo Y, Liu S, Xie T, Sui X. Biological functions of m6A methyltransferases. Cell Biosci. 2021 Jan 11;11(1):15.

6、Zhou J, Han Y, Hou R. Potential role of N6-methyladenosine modification in the development of Parkinson's disease. Front Cell Dev Biol. 2023 Dec 13;11:1321995.