經(jīng)典遺傳學(xué)理論認(rèn)為，DNA堿基序列作為遺傳信息的載體可以將親代性狀遺傳給子代。近年來(lái)，隨著對(duì)染色質(zhì)和組蛋白的深入研究，表觀(guān)遺傳學(xué)逐漸興起。表觀(guān)遺傳是指在DNA序列不發(fā)生改變的前提下，基因表達(dá)和表型發(fā)生可遺傳變化的現(xiàn)象。在表觀(guān)遺傳研究領(lǐng)域，選擇合適的研究技術(shù)至關(guān)重要。DAP-seq、ChIP-seq、CUT&Tag、ATAC-seq是表觀(guān)遺傳研究的常用技術(shù)，該如何選擇呢？接下來(lái)，小編將深入剖析這些技術(shù)，助您找到表觀(guān)遺傳研究的得力“助手"。
DAP-seq，全稱(chēng)為DNA親和純化測(cè)序（DNA Affinity Purification Sequencing），是一種基于體外重組蛋白的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)鑒定技術(shù)。該方法通過(guò)將體外表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子和基因組DNA進(jìn)行親和純化，然后洗脫與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的DNA片段，進(jìn)行高通量測(cè)序，生成轉(zhuǎn)錄因子的全基因組結(jié)合位點(diǎn)圖譜。DAP-seq打破了傳統(tǒng)ChIP-seq對(duì)抗體的依賴(lài)性，適用于非模式生物及抗體難以獲取的轉(zhuǎn)錄因子研究。同時(shí)由于采用體外結(jié)合體系，可保留DNA甲基化等表觀(guān)遺傳修飾對(duì)蛋白-DNA互作的影響，為表觀(guān)遺傳研究提供技術(shù)支持。
ChIP–seq，全稱(chēng)是染色質(zhì)免疫共沉淀測(cè)序（Chromatin Immunoprecipitation followed by Sequencing），是在體內(nèi)分離與特定蛋白結(jié)合的DNA片段的經(jīng)典方法。通過(guò)甲醛固定細(xì)胞內(nèi)DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物，再經(jīng)超聲或酶解將染色質(zhì)破碎成小片段；隨后，利用目標(biāo)蛋白（如轉(zhuǎn)錄因子、修飾組蛋白等）的特異性抗體，免疫沉淀蛋白DNA復(fù)合物，經(jīng)洗滌、解交聯(lián)后回收DNA；構(gòu)建文庫(kù)并高通量測(cè)序，將序列與參考基因組比對(duì)，即可精準(zhǔn)定位目標(biāo)蛋白結(jié)合位點(diǎn)。ChIP-seq能夠真實(shí)反映細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)與DNA的相互作用情況，為揭示基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制提供關(guān)鍵線(xiàn)索。
CUT&Tag，即靶向剪切及轉(zhuǎn)座酶技術(shù)（Cleavage Under Targets and Tagmentation），是用來(lái)研究組蛋白修飾以及蛋白質(zhì)與DNA之間的相互作用的新銳技術(shù)。在進(jìn)行CUT&Tag實(shí)驗(yàn)時(shí)，刀豆素A磁珠（ConA磁珠）通過(guò)特異性識(shí)別細(xì)胞表面糖基化分子，將細(xì)胞牢牢固定。依次加入目標(biāo)蛋白特異性抗體與二抗，結(jié)合目的蛋白并放大信號(hào)。隨后引入Protein A/G-Tn5融合轉(zhuǎn)座酶，這個(gè)融合酶就像是一個(gè)自帶“剪刀"和“標(biāo)簽"的分子機(jī)器。Protein A/G能夠與抗體特異性結(jié)合，引導(dǎo)Tn5轉(zhuǎn)座酶精準(zhǔn)地定位到目標(biāo)蛋白結(jié)合的染色質(zhì)區(qū)域，而Tn5轉(zhuǎn)座酶則會(huì)在切割DNA的同時(shí)，將測(cè)序接頭直接插入到切割位點(diǎn)兩端，完成對(duì)DNA片段的標(biāo)記。最后，僅需簡(jiǎn)單PCR擴(kuò)增，即可快速構(gòu)建高通量測(cè)序文庫(kù)。
相較傳統(tǒng)ChIP-seq技術(shù)，CUT&Tag實(shí)驗(yàn)周期從3-5天縮短至1-2天，細(xì)胞用量從百萬(wàn)級(jí)降至千級(jí)，同時(shí)顯著降低背景噪音，尤其適用于微量樣本的高靈敏度蛋白-DNA互作研究，為生命科學(xué)領(lǐng)域打開(kāi)了新的研究窗口。
ATAC-seq，染色質(zhì)可及性測(cè)序（Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing），是探索全基因組染色質(zhì)可及性的前沿技術(shù)。其核心原理基于轉(zhuǎn)座酶對(duì)開(kāi)放染色質(zhì)區(qū)域的偏好性。在細(xì)胞內(nèi)，DNA 與組蛋白纏繞形成染色質(zhì)，而染色質(zhì)的松緊狀態(tài)直接決定了DNA片段能否被轉(zhuǎn)錄因子等調(diào)控蛋白識(shí)別。那些處于松散、開(kāi)放狀態(tài)的染色質(zhì)區(qū)域，正是基因表達(dá)調(diào)控的“活躍地帶"。
ATAC-seq借助高活性的Tn5轉(zhuǎn)座酶突變體，精準(zhǔn)定位基因組中的開(kāi)放染色質(zhì)區(qū)域。攜帶特定 DNA 序列標(biāo)簽的Tn5轉(zhuǎn)座復(fù)合物與細(xì)胞核共同孵育時(shí)，轉(zhuǎn)座酶會(huì)切割開(kāi)放染色質(zhì)區(qū)域的DNA，并快速為切割位點(diǎn)兩端添加測(cè)序接頭，隨后進(jìn)行PCR擴(kuò)增和高通量測(cè)序，最后通過(guò)分析測(cè)序數(shù)據(jù)中reads的分布，即可清晰描繪全基因組染色質(zhì)的開(kāi)放圖譜，鎖定潛在的基因調(diào)控位點(diǎn)與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合區(qū)域。該技術(shù)具有操作簡(jiǎn)便、耗時(shí)短（3小時(shí)內(nèi)即可完成實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備）、樣本需求量少等優(yōu)勢(shì)，同時(shí)可支持單細(xì)胞或微量樣本分析。
為了更直觀(guān)地展現(xiàn)這四種技術(shù)的差異，我們通過(guò)以下表格來(lái)詳細(xì)對(duì)比它們?cè)跇颖拘枨?、靈敏度、實(shí)驗(yàn)周期、成本等方面的特點(diǎn)：
在實(shí)際的表觀(guān)遺傳研究中，選擇合適的技術(shù)就如同為不同的旅程挑選合適的交通工具，需要根據(jù)具體的研究目標(biāo)、樣本類(lèi)型和資源條件等因素來(lái)綜合考量。
DAP-seq在解析轉(zhuǎn)錄因子與DNA結(jié)合位點(diǎn)上具有優(yōu)勢(shì)，特別適用于難以獲取高質(zhì)量抗體的樣本，尤其是非模式生物研究。在植物領(lǐng)域，許多物種缺乏成熟抗體資源，DAP-seq技術(shù)為此開(kāi)辟了新路徑
染色質(zhì)免疫共沉淀測(cè)序（ChIP-seq）是研究蛋白質(zhì)與DNA相互作用的經(jīng)典技術(shù)，適用于樣本充足且具備高質(zhì)量特異性抗體的實(shí)驗(yàn)場(chǎng)景。該技術(shù)能夠在體內(nèi)生理環(huán)境下，系統(tǒng)解析蛋白質(zhì)與DNA的結(jié)合圖譜，為基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究提供關(guān)鍵信息。
CUT&Tag技術(shù)以低樣本量需求和高靈敏度的顯著優(yōu)勢(shì)，成為微量樣本及單細(xì)胞研究的核心工具。該技術(shù)能在單細(xì)胞層面高分辨率解析蛋白質(zhì)與DNA的互作關(guān)系，為探究細(xì)胞異質(zhì)性及發(fā)育進(jìn)程中的基因調(diào)控奧秘提供了關(guān)鍵手段。
ATAC-seq聚焦染色質(zhì)開(kāi)放性研究，可高效探索全基因組染色質(zhì)開(kāi)放區(qū)域與潛在調(diào)控元件，憑借樣本需求量少、檢測(cè)靈敏快速的優(yōu)勢(shì)，成為解析基因表達(dá)調(diào)控的重要技術(shù)。
通常單一技術(shù)難以滿(mǎn)足復(fù)雜研究需求，技術(shù)組合可提供更全面的研究視角。ATAC-seq與ChIP-seq、CUT&Tag或DAP-seq結(jié)合，能同時(shí)獲取染色質(zhì)開(kāi)放性與蛋白質(zhì)-DNA結(jié)合位點(diǎn)信息，幫助研究者深入解析基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。ATAC-seq與RNA-seq聯(lián)合使用，可關(guān)聯(lián)染色質(zhì)開(kāi)放性與基因表達(dá)變化，助力探索基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制。
DAP-seq、ChIP-seq、CUT&Tag、ATAC-seq四種技術(shù)在表觀(guān)遺傳研究中各展所長(zhǎng)，其原理、特點(diǎn)與適用場(chǎng)景各異，我們需要結(jié)合具體研究需求和條件，才能做出合適的選擇。歡迎感興趣的同學(xué)前來(lái)咨詢(xún)！
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